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          小分子靶蛋白降解劑開創小分子藥物嶄新時代

          發布時間:2020-06-01 11:29:35 | 來源:【藥物研發團隊 2020-06-01】
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          藥物治療是保護人類生命安全和身體健康的重要方法和手段。但生命科學的研究是一個不斷探索發展的過程,一些復雜疾病由于對其病因病機認識的不足以及藥物技術的限制而難以治愈;一些新病原體引發的新疾病,特別是新病毒感染性疾病引起的突發重大公共衛生事件,對人類的生命安全和身體健康造成嚴重威脅。因此,除了在生命科學和醫學領域不斷增強基礎研究及轉化醫學研究外,藥物技術的突破將成為復雜疾病治療和突發重大公共衛生事件處置的有效途徑,藥物研發已成為公共安全體系的剛需。

          細胞是生物體結構和功能的基本單位。已知除病毒之外的所有生物均由細胞所組成,但病毒生命活動也必須在細胞中才能體  現。蛋白質是組成人體一切細胞、組織的重要成分。機體所有重要的組成部分都需要有蛋白質的參與。人類的許多疾病與蛋白質的異常表達有關,因此,靶向蛋白的藥物治療對于疾病的防治具有極其重要的意義。

          藥物發現的經典方法通常是開發能識別并能調節靶蛋白活性的高親和力抑制劑,通過與靶蛋白結合位點結合并占據靶蛋白結合位點而發揮抑制靶點的功能,這種策略對于許多靶點都非常成功。但大多數蛋白質缺乏有效的結合部位以及合適的化學物質,致使80%~90%的人類蛋白質組“不可成藥”。小分子藥物的發現一直在尋找解決“不可成藥”蛋白的方法。

          靶向蛋白質降解(TPD)因具有高度選擇性和有效性在過去十幾年引起了化學生物學和藥物研究領域的極大興趣,成為藥物研發領域的一個新興方向,為疾病的防治提供了一種全新的方案。

          自從人類基因組被解讀以來,研究人員就在試圖靶向成千上萬導致疾病的蛋白。但是他們發現傳統的小分子和抗體藥物只能靶向大約20%的蛋白。這一局限性給了基于RNA的藥物和基因編輯技術很大的發展空間,因為它們有可能靶向另外80%的蛋白。但是這些新技術也需要面對一系列挑戰,其中包括藥物遞送問題、藥效和安全性問題。

          蛋白靶向降解藥物力圖將小分子設計成為一種新型藥物,傳統小分子的作用是阻斷蛋白的功能,而蛋白靶向降解劑的作用是通過將這些蛋白送入蛋白酶體  將它們完全降解,具有高度選擇性和有效性。通過誘導靶蛋白的降解,靶蛋白降解劑可以表現出與抑制劑不同的生物學特性。在不是很遠的未來藥物研發中,尋找小分子靶蛋白降解劑而不是抑制劑將成為一種普遍的策略,這種新興藥物具有的巨大發展前景,將開創藥物研發的嶄新時代。這是一個偉大而激動人心的時代,我們可以在這個時代致力于靶蛋白降解技術的研究并積極地進行下一代小分子藥物的開發。

          一、蛋白降解機制

          天然蛋白的降解主要通過細胞膜中的泛素-蛋白酶體系統和自噬性溶酶體二個途徑發生。

          泛素-蛋白酶體系統

          泛素-蛋白酶體系統(UPS)是細胞內蛋白質降解的主要途徑,參與細胞內80%以上蛋白質的降解。

          泛素-蛋白酶體系統蛋白降解途徑是一個多步驟反應過程,有多種不同蛋白質參與。蛋白質先被泛素(多肽)標記,然后被蛋白酶體識別和降解。通過這樣一個需要消耗能量的過程,細胞以高度特異方式對不需要的蛋白進行降解。

          泛素-蛋白酶體系統包括泛素、泛素活化酶E1、泛素結合酶E2、泛素-蛋白連接酶E3、蛋白酶體及其底物和泛素解離酶。

          1、泛素-蛋白酶體系統的結構

          泛素-蛋白酶體系統由泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素結合酶(E2)、泛素連接酶(E3)、蛋白酶體及其底物(蛋白質)構成。

          (1)泛素:含有76個氨基酸殘基,分子量約8.5kDa,廣泛存在于真核細胞(原核細胞中尚未發現)。泛素鏈與蛋白底物的結合形成被蛋白酶體降解的識別信號。另外,泛素化在蛋白的內吞和外泌作用中有目標定位功能。(2)泛素活化酶E1:通過半胱氨酸殘基與泛素C端活化的甘氨酸殘基形成硫酯鍵,E1-泛素中間體中的泛素可以轉移給數個E2。

          (3)泛素結合酶E2:以泛素結合酶方式起作用,活性部位為半胱氨酸,部分E2成員在細胞特定過程中發揮作用,但E2的全部作用尚不清楚。

          (4)泛素連接酶E3:為泛素-蛋白酶體系統選擇性降解機制的關鍵因素,識別被降解的蛋白并將泛素連接到底物上。

          (5)蛋白酶體(2.5MDa):由2個19S和1個20S亞單位組成的桶狀結構,19S為調節亞單位,位于桶狀結構的兩端,識別多聚泛素化蛋白并使其去折疊。19S亞單位上還具有一種去泛素化的同功肽酶,使底物去泛素化。20S為催化亞單位,位于兩個19S亞單位的中間,其活性部位處于桶狀結構的內表面,可避免細胞環境的影響。酵母20S亞單位由四個環狀結構(αββα)組成。

          2、泛素-蛋白酶體系統的作用

          泛素-蛋白酶體系統是細胞內一系列生命進程的重要調節方式,與疾病的發生發展關系密切。研究證實,泛素-蛋白酶體系統在心血管疾病中具有重要的病理生理學意義,可調節動脈粥樣硬化、缺血后再灌注損傷、家族性心肌病、心肌肥厚和心臟衰竭等重要疾病的發生和發展。另外,最新的研究表明,泛素-蛋白酶體系統的重要作用還在于其被充分利用后,可以代謝諸如毒素、脂肪、癌細胞在內的人體垃圾,另外代謝產生的能量可刺激細胞進行自我復制以完成人體的自我代謝修復功能。

          自噬性溶酶體

          自噬性溶酶體又稱胞溶酶體,它是初級溶酶體與來自自噬作用的含有內源性物質的囊泡即自噬體融合或溶酶體吞噬細胞質而形成,在細胞內起“清道夫”作用。

          1、自噬性溶酶體的形成

          細胞內由于生理或病理原因而被損傷的細胞器,或過量儲存的糖元等,它們可被細胞自身的膜(如內質網或高爾基復合體的膜)包裹形成自噬體,自噬體與初級溶酶體接觸,兩者融合形成自噬性溶酶體。

          自噬性溶酶體也可以通過溶酶體本身的內陷,并包圍一部分細胞質成分而成(但一般較少)。在自噬性溶酶體內的內源性物質被溶酶體的酶消化分解的過稱為自噬。

          2、自噬性溶酶體的作用

          自噬性溶酶體是一種自體吞噬泡,作用底物是內源性的,即細胞內的蛻變、破損的某些細胞器或局部細胞質。這種溶酶體廣泛存在于正常的細胞內,在細胞內起“清道夫”作用,作為細胞內細胞器和其它結構自然減員和更新的正常途徑。在組織細胞受到各種理化因素傷害時,自噬性溶酶體大量增加,因此對細胞的損傷起一種保護作用。

          自噬性溶酶體的作用底物是內源性的,即來自細胞內的衰老和崩解的細胞器或局部細胞質等。它們由單層膜包圍,內部常含有尚未分解的內質網、線粒體和高爾基復合體或脂類、糖原等。正常細胞中的自噬性溶酶體在消化、分解、自然更替一些細胞內的結構上起著重要作用。當細胞受到藥物作用、射線照射和機械損傷時,其數量明顯地增多。在病變的細胞中也??梢姷阶允尚匀苊阁w。

          二、蛋白靶向降解藥物作用機制

          基于機制的藥物發現是當今藥物開發的主流方式,其核心是尋找和發現可靠的藥物靶標。發現和確證藥物靶標是基于機制開發新藥的前提條件和決定性因素。長期以來,制約基于機制的藥物發現的主要困難是缺乏可靠的生物學靶標。

          隨著人類基因組計劃的完成,以及與之伴生的基因組學和蛋白質組學的理論及實驗結果分析技術的快速發展,疾病相關 靶標的發現與確證速度越來越快,有不少非酶蛋白被確定為藥物靶標,這些新鑒定確證的生物學靶標與特定疾病的關聯性更強,極大地拓展了創新藥物研究的可能靶標范圍。但是,這些新鑒定確證的非酶靶標難以用傳統的、基于機制的、通過占據活性位點的調控方式來發現和設計疾病治療藥物。與傳統的基于生物學功能鑒定出的靶標不同,基于組學分析鑒定出的靶標中有許多非酶蛋白,如轉錄因子、骨架蛋白等。這類靶標相較于傳統的藥物靶標,如酶、G蛋白偶聯受體和離子通道等有較大的不同,通常不直接執行具體的功能,且缺乏明顯的活性位點。

          對于傳統的靶標蛋白,小分子藥物可通過與蛋白的活性位點結合,直接阻斷其特定的功能發揮治療作用。而這些非酶蛋白通常不具備直接的生物學功能,難以通過結合和占據靶標的特定位點而直接調控其活性。因此,傳統意義上認為這類蛋白質為“不可成藥‘’靶標,從而極大地限制了快速增加的此類靶標在創新藥物研發中的運用。

          對于一些復雜疾病,即使靶向目前認為“成藥”的靶標,現有基于機制的藥物由于只占據一個或幾個活性位點,而存在藥效和耐藥性等問題,使疾病的治療受到限制。因此,無論是針對傳統的“成藥”靶標,還是針對新興的“不可成藥”靶標,都亟需發展一種新型技術,使疾病能夠得到有效治療。

          靶向蛋白降解劑就是一種新型技術,它通過劫持內源性蛋白質降解機制(泛素-蛋白酶體系統或自噬性溶酶體)來誘導蛋白質進行降解,只需一個結合劑來招募目標蛋白(并不需要高親和力抑制劑),從而有可能瞄準不可治療的蛋白質組。除了治療潛力,蛋白質降解劑還是驗證靶標且深入了解蛋白質功能和細胞途徑的有效工具。

          RNA或基因組編輯工具相比,靶向蛋白降解劑的一個優點是目標蛋白的急性和快速消耗避免了不必要的適應事件,并且能夠以反復循環的周期率進行消耗;與RNAi、反義寡核苷酸或基因組編輯等基于核苷酸的方法相比,靶向蛋白降解劑由于體內穩定性和生物利用度較低而受到應用限制。因此,不斷發展和完善靶向蛋白降解技術,對于新型藥物的研發具有重要意義。

          三、靶向蛋白降解類型

          目前,靶向蛋白降解主要分為標記靶蛋白的降解和未標記靶蛋白的降解兩大類。

          已標記靶蛋白的蛋白質標簽主要包括肽序列或蛋白質,它們與目標蛋白質(POI)融合無需識別合適的結合物,如小分子、肽或抗體,此類降解需要預先修改靶細胞/生物體的基因組來限制標記靶蛋白的降解,主要應用于化學生物學和靶點驗證研究領域,在創新藥物研發領域也有極其廣闊的應用前景。

          未標記靶蛋白降解依賴于確定合適的靶標結合物,它因獨立于生物體的基因改變而更具有普適性。

          標記靶蛋白的降解

          通過控制蛋白質活性和豐度來更好地理解和驗證靶標是一種非常強大的方法。在藥物開發的目標發現和驗證階段,通常沒有合適的結合物用于降解內源性蛋白質。通過融合一個蛋白質標簽到目標蛋白質來實現對標記蛋白質的選擇性識別??稍谀繕说鞍踪|的N-或C-末端引入短氨基酸序列或蛋白質結構域的各種標記,一些標記僅允許對靶標蛋白進行選擇性尋找,另一些則直接導致其降解。為了減少對系統的干擾,蛋白質標簽應使用CRISPR/Cas等基因內插入到宿主基因組中的方法,也可以考慮其他方法,如以瞬時或穩定的方式轉染/轉導DNA編碼質粒等。

          標記靶蛋白的降解主要有蛋白降解子、標簽特定的降解劑、納米抗體誘導靶標降解等。

          1、蛋白降解子[1]

          蛋白質的正常表達及降解對維持細胞功能平衡至關重要,當蛋白質功能異?;蛏锖铣傻劝l生錯誤時,會被識別、標記并被迅速降解,從而保證細胞生存環境的穩定。細胞內的蛋白降解,依賴于蛋白酶系統對特定氨基酸序列或構象變化的識別。由泛素-蛋白酶體系統(UPS)自然降解的蛋白質顯示出特定降解信號,稱為蛋白降解子(Degron),它代表E3連接酶結合的基序。蛋白降解子是蛋白上包含的一段特定氨基酸序列,可被細胞內的蛋白酶識別,以介導蛋白的降解清除。大多數蛋白降解子存在于編碼蛋白的DNA序列中,少數是在翻譯過程中或翻譯后添加到靶蛋白上,蛋白降解子通常位于蛋白的N末端或C末端,因而容易被蛋白酶或其他連接蛋白識別并結合。相對于蛋白C端的降解信號,蛋白N端附近的序列與降解的相關性更為密切,有時N端一個氨基酸的改變甚至可以使蛋白質對蛋白酶變得敏感,稱為N端法則。N端法則主要存在于泛素-蛋白酶體系統降解途徑中,通過N末端特定氨基酸殘基以及翻譯后修飾(PTM)共同影響蛋白質的體內半衰期。

          蛋白降解子能快速并可逆誘導體內蛋白降解。通過與目的基因進行結合,蛋白降解子可以靶向調控幾乎任何蛋白的表達,成為研究蛋白功能及信號傳導等細胞分子機制的利器。蛋白降解子范圍從單個氨基酸到短肽序列或結構域,并且可以在蛋白質之間轉移。因此,在任何類型蛋白上加上一個蛋白降解子都會導致其降解。許多能被小分子、光或溫度激活的蛋白降解子已成功誘導靶蛋白降解。

          蛋白降解子是蛋白質的一部分,存在于各種生物體中。雖然有許多不同類型的蛋白降解子,并且即使在同種類型的蛋白降解子中存在高度變異性,但它們在調節蛋白質降解速率方面都是相似的。

          (1)蛋白降解子的種類

          迄今為止,基于蛋白降解子原理開發的蛋白降解系統已有多種,依據其誘導方式,大致可分為小分子誘導、溫度誘導、光誘導三種蛋白降解子系統。

          ①小分子誘導的蛋白降解子系統

          小分子誘導蛋白降解子系統是指利用一些生物激素或化學小分子物質來控制蛋白降解子的活化,主要有正向激活的蛋白降解子和反向調控的蛋白降解子,其中,植物激素誘導的蛋白降解子系統AID是小分子誘導正向激活的蛋白降解子的典型代表,小分子輔助開關SMASh是小分子誘導反向調控的蛋白降解子的典型代表。

          目前,已被應用的蛋白降解子系統有植物激素誘導蛋白降解子(AID)、不穩定域(DD)、配體誘導的降解(LID)、煙草病毒蛋白酶誘導的蛋白質失活(熒光蛋白的降解(deGradFP)、小分子輔助開關(SMASh)、泛素破壞降解(SURF)等。

          ②溫度誘導的蛋白降解子系統

          溫度誘導的蛋白降解子系統(ts-Degron或TSD)目前主要是通過從小鼠中克隆的二氫葉酸還原酶(DHFR)的一種突變來實現,利用其對溫度的敏感性來激活蛋白降解子。該系統不僅反應快速,而且可逆,僅需改變溫度條件即可誘導蛋白降解子,因而可方便地用作調控細胞內蛋白質水平的快速開關系統。

          ③光誘導的蛋白降解子系統

          光誘導的蛋白降解子系統(PSD或B-LID)包括從擬南芥中克隆的光-氧-電壓(LOV)調控系統,以及來源于小鼠的鳥氨酸脫羧酶(ODC)系統,其原理一般是通過光來誘導特定光敏蛋白構象變化或去離子化,并進而影響與其相連接的蛋白降解子結構變化,由非活性構象轉化為活性構象,進而導致融合蛋白被蛋白酶體降解。目前,光誘導的蛋白降解子已被用于線蟲等生物體?;诠膺z傳學在神經科學研究中的重要性,光控制的蛋白降解子可能在這個領域有巨大應用前景。

          (2)蛋白降解子的生理功能及應用

          蛋白降解是細胞內蛋白調控的核心功能之一。近年來發展起來的蛋白降解子技術在蛋白調控、細胞信號傳導機制研究以及基因治療藥物開發等領域具有巨大的潛在應用價值。

          癌癥的產生是大量基因突變積累的產物,超過一半的癌癥中含有p53基因突變。同時,癌癥中基因也常表達異常,出現基因重復、染色體非整倍性或重構,導致原癌基因表達上升以及抑癌基因表達下降。鑒于大多數降解子是嵌入在模塊蛋白質序列的短序列,屬于蛋白質豐度的調節位點,因而對于許多細胞過程的調控(如調節細胞周期和監測細胞代謝)極為重要。此外,降解子能消除不需要的蛋白質,防止其可能導致的細胞功能障礙,癌基因表達的增強和抑癌基因豐度的減少均與蛋白質降解機制相關。因此,了解蛋白質降解機制對于許多疾病,尤其是癌癥顯得至關重要。

          蛋白降解子不僅對癌癥等疾病治療有潛在的重要應用,還可以作為其他分子技術的輔助工具,如基因編輯技術等。需要指出的是,人類蛋白質中已知約存在600個E3連接酶,但目前僅定義了大約28種類型的蛋白降解子基因序列。對蛋白降解子的深入研究,不僅將促進基礎生物學機制的研究,在藥物開發領域也有廣闊的應用前景。

          2、標簽特定的蛋白降解劑

          標簽特定的蛋白降解劑是一種非常強大的工具,能快速實現一系列目標蛋白的靶向降解,而不需要識別一個特定的結合物。在這種情況下,蛋白降解分子被優化以接合蛋白標簽,從而去除目標蛋白融合結合物,目前廣泛使用的兩個主要標簽是HaloTag和dTag體系。

          HaloTag是一種自標記標簽,它共價結合到氯代烷烴上,可以使用所選擇的合成配體對HaloTag蛋白進行高選擇性共價標記,將E3連接酶結合物連接到氯代烷烴鹵代標記配體可導致目標蛋白結構的選擇性有效降解。迄今為止,鹵代標記蛋白降解劑被設計用于劫持VHL和IAP E3連接酶。它們在低納米摩爾范圍內能有效地誘導過表達模型中的融合蛋白降解,并與內源性CRISPR-Cas基因相結合。由于鹵化物蛋白降解劑的共價性質以及隨后與目標蛋白一起從系統中去除,因此必須按化學計量使用。

          相比之下,使用dTag系統可實現二價降解劑的亞化學計量以實現全目標蛋白降解。dTag方法包括融合到目標蛋白的FKBPF36V蛋白標簽和二價降解劑分子(dTag)。dTag在一個位點選擇性地與FKBP結合,在另一個位點與E3連接酶CRBN結合,從而誘導融合蛋白結構物的降解。dTag方法已在各種疾病模型中多次用于靶點驗證。與HaloTag系統相比,dTag具有催化作用,并且已經證明在體內外應用中都有效。

          3、納米抗體誘導靶標降解

          實現選擇性蛋白降解的另一個策略是基于融合到E3連接酶的基因編碼納米抗體。這項技術通常使用特定的納米抗體降解綠色熒光蛋白-目標蛋白融合結構。納米抗體來源于駱駝類物種,是一種小的單鏈多肽抗體,可以針對不同的抗原進行培養。這些降解劑直接針對目標蛋白本身,從而允許基因編碼標簽不被誘導降解。


          未標記蛋白的降解

          靶向未標記蛋白質的優點是不需要基因改變就可以預先修改系統。這種設置更接近于病理狀態,因為沒有標簽會妨礙目標蛋白的功能、表達和可用性,并允許在不同細胞系甚至不同生物體或物種之間快速切換。能夠降解未標記的靶蛋白是向治療應用轉化的關鍵,而是否有合適的靶標結合物來結合所需的靶蛋白或新的策略來識別是決定性因素。

          目前,未標記蛋白的降解主要有基于疏水標記的蛋白降解、分子膠蛋白降解和基于泛素E3連接酶的蛋白降解三種方式。

          1、基于疏水標記的蛋白降解[2]

          基于疏水標記的誘導蛋白質降解的基本原理是設計包含雙官能團的化合物,一端是大疏水基團;另一端是靶標蛋白的小分子配體,用于識別和結合待降解的蛋白。兩個官能團通過合適的連接鏈連接,進而達到模擬靶蛋白暴露出疏水表面的目的,誘導蛋白降解。此策略已在數個靶標蛋白上取得了一定的進展。這種方法的劣勢也較為明顯,最為突出的是其所連接的疏水基團具有較明顯的非特異性結合性質,在體內會與諸多靶標結合,帶來選擇性問題,同時這類化合物的生物利用度低,通常表現為不完全靶標降解,限制了其發展。

          2、分子膠蛋白降解[3]、[4]

          分子膠蛋白降解是通過修飾泛素化連接酶的特定區域或位點,使其擁有識別并降解全新底物的特性,例如免疫調節劑沙利度胺和磺胺類抗腫瘤藥等。由于其小分子和相關的類藥性質,使分子膠在靶蛋白降解領域的臨床轉化應用非常值得期待,但分子膠的設計仍然依賴于偶然的發現。

          3、基于泛素E3連接酶的蛋白降解[2]、[5]、[6]

          基于泛素E3連接酶的蛋白降解劑又稱為蛋白水解靶向嵌合體(PROTAC),其通過一段具有不同長度的連接分子(linker)將泛素化連接酶和靶蛋白的配體連接起來從而達到使泛素化連接酶識別并降解特定底物的功能,被認為是最具發展潛力、最具有突破性的藥物研發技術。

          近十幾年來,PROTAC突飛猛進發展,涌現出一批新技術、新方法,使PROTAC不斷改進和完善,并不斷接近臨床應用,如小分子配體設計、結晶三元復合物設計、連接鏈設計、光控靶蛋白降解及其降解劑(PHOTAC)、自噬介導的靶蛋白降解及其降解劑(AUTAC)、靶向TRIM蛋白家族的降解、基因編碼靶蛋白降解劑(BioPROTAC)等。此外,為了彌補PROTAC只能降解細胞內靶蛋白的局限性,作為PROTAC的補充,細胞外靶向降解(ENDTAC)以及靶向細胞外蛋白、可降解細胞外蛋白和細胞膜蛋白的溶酶體靶向嵌合體(LYTAC)應運而生,極大地拓展了靶標和疾病治療范圍。

          (1)光控靶蛋白降解

          光控靶蛋白降解(PHOTAC)可以使用不同波長的可見光在生物活性和非生物活性狀態之間進行切換,可以更精準地進行靶蛋白降解。

          (2)自噬介導的靶蛋白降解

          自噬是蛋白質降解的第二個主要途徑,在降解錯誤折疊的蛋白質、聚集體,特別是整個細胞器中起著關鍵作用。在最近的一項研究中發現,自噬途徑通過誘導線粒體破裂而降解靶蛋白。該途徑基于S-鳥苷酸衍生物作為自噬嵌合體(AUTAC)。由于其作用方式,AUTAC僅限于胞漿靶點且無法以催化的方式作用。因此,自噬介導的靶蛋白降解比分子膠或PROTAC所觀察到的催化轉化更能準確地理解為將靶蛋白裝載到自噬體上并隨后降解。

          (3)靶向TRIM蛋白家族的降解

          TRIM家族是一個結構保守、進化快速的蛋白家族,它參與了細胞凋亡、周期調控、細胞對病毒的應答等重要的生命過程。結構上的保守預示著TRIM蛋白家族可能是以一種共同的機制參與各種生命過程。研究表明,TRIM家族是一類鋅指E3泛素連接酶。

          PROTAC相比,靶向TRIM蛋白家族的降解在化學生物學和靶點驗證方面具有巨大的潛在價值。靶向TRIM蛋白家族的降解利用識別抗體恒定Fc區域的內源性泛素連接酶TRIM21,靶向目標蛋白的抗體在TRIM21識別時通過蛋白酶體誘導蛋白抗體復合物迅速泛素蛋和降解。與PROTAC的催化性質相反,靶蛋白、抗體和TRIM21水平可能不足以達到完全的目標降解,這需要通過過度表達或外部添加TRIM21來補充。靶向TRIM蛋白家族的降解對于靶點驗證尤其有用,并且可應用于常規功能喪失的不可分裂原代細胞。

          (4)基因編碼靶向蛋白降解劑

          目標蛋白降解劑的合理設計依賴于合適的目標結合物的可用性。在600多個人類E3泛素連接酶中,PROTAC主要利用其中的4個。為了進一步擴大PROTAC的應用范圍,需要尋找更多合適可用的目標結合物??茖W家們應用基因工程技術,通過基因編碼將肽或抗體模擬物構建成E3泛素連接酶,用于降解靶蛋白,并將這種技術稱之為基因編碼靶向蛋白降解或生物工程靶向蛋白降解(BioPROTAC)。這種技術可以指導選擇最合適的E3連接酶,但由于這種技術依賴于基因編碼,因此僅限于開展化學生物學相關研究應用。

          (5)細胞外靶向蛋白降解

          靶向蛋白降解療法是備受業界關注的創新治療模式。這種小分子靶向降解劑可以利用細胞自身的蛋白酶體來降解致病蛋白。然而,這種通常被稱為PROTAC的蛋白降解技術只能靶向細胞內蛋白。而諸如生長因子、細胞因子等細胞外蛋白可以通過與細胞表面的受體相結合,在多種疾病中引發異常信號傳導。

          Crews博士率領的研究團隊利用細胞的內吞作用和溶酶體介導的蛋白降解設計出了靶向降解細胞外蛋白的新技術平臺。受體介導的內吞作用能夠將與細胞表面受體結合的蛋白“吞入”至細胞內部,內吞作用形成的內體與溶酶體的結合能夠將內體攜帶的蛋白降解。

          Crews博士的團隊設計出一種稱為ENDTAC的雙特異性小分子。它的一端可以與細胞外靶點蛋白結合,另一端能夠與細胞表面介導內吞作用的受體相結合,這種分子通過將需要降解的細胞外蛋白與細胞表面的受體連接起來,觸發內吞過程,將靶點蛋白“吞入”細胞中通過溶酶體降解。

          該團隊研究人員進行了概念驗證實驗。他們設計了一種ENDTAC分子,一端可以與細胞表面的G蛋白偶聯受體CXCR7結合,另一端可以與一款重組GFP蛋白相結合。在天然狀況下,CXCR7受體本身不斷被內吞并且將與之結合的化學因子遞送到溶酶體中降解。實驗結果表明,ENDTAC分子能夠引起GFP蛋白被內吞并且被溶酶體降解。細胞表達的CXCR7受體水平越高,ENDTAC分子引發的GFP蛋白降解效果越好。

          PROTAC技術的最大優點就是它為靶向“不可成藥”的細胞內蛋白提供了新的靶向方法,但其局限性是它們無法靶向細胞外蛋白。ENDTAC是一種將降解機制擴展到細胞外的手段,這一技術平臺可以擴展到使用其它細胞表面受體來介導內吞和蛋白降解過程。我們期待新的ENDTAC分子能夠提供靶向細胞外靶點的新途徑。

          (6)溶酶體靶向嵌合體

          溶酶體嵌合體(LYTAC)可降解胞外和膜蛋白,它是一種雙功能分子,包含一種針對細胞外靶蛋白的抗體,該抗體與陽離子獨立的甘露糖-6-磷酸受體(CI-M6PR)的激動性糖肽配體融合。CI-M6PR在配體結合時內化并將其轉運至溶酶體降解,而受體自身則被循環利用并穿梭回細胞膜。首次概念驗證研究證明了LYTAC能成功降解表皮生長因子受體(EGFR)、程序性死亡配體1(PD-L1)和載脂蛋白E4。目前還需要進一步的研究來評估這項技術的潛力及潛在治療應用價值。

          四、展望

          近年來取得的各種成就突出表明,靶向蛋白降解已經從生物學概念轉變為藥物開發研究的可行方法。以分子膠形式存在的靶向蛋白降解劑已有藥物獲批上市。PROTAC這一非常年輕的領域在2019 年已有藥物進入臨床試驗。在基因編輯技術(CRISPR/Cas)和化學蛋白質組學的基礎上,靶向蛋白降解將作為化學生物學的一個強有力的策略,在靶點驗證和靶點挖掘領域蓬勃發展。由于許多靶向蛋白降解方法已經允許在體內進行靶點驗證,這將靶向蛋白降解推向更高的水平。

          已經確定了幾種具有不同選擇性的CRBN調節劑,目前有三種正在臨床試驗中進行評估。除了分子膠外,PROTAC迅速進入了I期臨床試驗階段。然而,迄今為止報道的大多數PROTAC都是基于已經驗證的靶標。為了在探索新的臨床模式時降低風險,目前這種僅針對已驗證的靶標研發PROTAC藥物的策略是謹慎的、合理的。但是為了充分發揮PROTAC的潛力并擴大可用藥空間,必須探索出一種新的藥物發現思維方式。降解劑可以表現出與抑制劑不同的生物學特性,并能解決支架作用和酶功能。在未來的研究中,尋找小分子靶蛋白降解劑而不是抑制劑將成為一種普遍的策略。

          考慮到最近靶向蛋白降解的成功,PROTAC領域的專家們期盼達到預計目標。盡管第一批人類PK數據看起來很有前途,但PROTAC要想獲得批準上市還有很長的路要走,如何為一個給定的目標設計完美的PROTAC技術規范仍有待建立健全。到目前為止,體內外數據之間的相關性仍然是設計設計PROTAC的一個巨大的挑戰。此外,為了更有選擇性解決某些疾病或增加治療窗口,科學家們正在進行巨大的努力來識別和劫持組織或疾病特異性E3泛素連接酶。

           

          文獻資料

          [1] 馬文建等,Degron—細胞蛋白的快速降解及可逆調控技術,天津科技大學學報,2018,33(6)1~8

          [2] 尤啟東等,靶向誘導蛋白降解作為藥物開發新策略,藥學學報,2017,52(12)1777~1782

          [3] Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J. &Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation throughmodulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochem. J.474, 1127–1147(2017).

          [4] Hughes, S. J. & Ciulli, A. Molecularrecognition of ternary complexes: a new dimension in the structure-guideddesign of chemical degraders.Essays Biochem. 61, 505–516(2017)

          [5] Zorba, A. et al. Delineating the role ofcooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. Proc. Natl Acad. Sci.USA 115, E7285–E7292 (2018)

          [6] 田利源等,一個新的泛素化有關的蛋白家族—TRIM家族,生物技術通訊,2007,18(2)270~273


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